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Crispr/cas系统基因编辑用核酸内切酶Cas9,Cas12a,Cas12b,Cas13a,Cas14a区别

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发表于 2023-5-29 01:26:39 | 显示全部楼层 阅读模式

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CRISPR/Cas系统是一种原核生物的免疫系统,用来抵抗外源遗传物质的入侵,比如噬菌体病毒和外源质粒。CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA,并将它们切断,沉默外源基因的表达。正是由于这种精确的靶向功能,CRISPR/Cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具。上海惠诚生物提供Crispr/Cas系统用核酸内切酶:Cas9,Cas12a,Cas12b,Cas13a,Cas14a。从下表中可以看出不同Crispr酶在向导RNA,是否需要PAM和Target片段的区别。CRISPR Cas12a蛋白和CRISPRCas12b蛋白是CRISPR Cas蛋白 Class2 V型中的亚型,V-A cas12a, 又叫cpf1; V-B cas12b, 又称 c2c1。
CRISPR/Cas系统是一种原核生物的免疫系统,用来抵抗外源遗传物质的入侵,比如噬菌体病毒和外源质粒。同时,它为细菌提供了获得性免疫:这与哺乳动物的二次免疫类似,当细菌遭受病毒或者外源质粒入侵时,会产生相应的“记忆”,从而可以抵抗它们的再次入侵。CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA,并将它们切断,沉默外源基因的表达。这与真核生物中RNA干扰(RNAi)的原理是相似的。正是由于这种精确的靶向功能,CRISPR/Cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具。
上海惠诚生物提供Crispr/Cas系统用核酸内切酶:Cas9,Cas12a,Cas12b,Cas13a,Cas14a。

从下表中可以看出不同Crispr酶在向导RNA,是否需要PAM和Target片段的区别。
Crispr酶向导RNA,PAM和Target表

       

                               
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Cas9的作用机制:
CRISPR-Cas9系统包括一个gRNA(或sgRNA) 和 Cas9 核酸酶,它们共同形成一个核糖核蛋白(RNP)复合物。Cas9 蛋白识别的 PAM 序列是 5′-NGG-3’,其中 N 代表任意核苷酸。如果 PAM 序列匹配正确,并且 gRNA 成功地与目标位点结合,那么 Cas9 会在 PAM 序列上游约 3-4 个核苷酸进行 DNA 双链的切割。
gRNA,也称为sgRNA(“ s”代表单写,它们是同一回事)。gRNA是人类人工制造的,自然界中不存在。这种gRNA设计基于自然存在的crRNA和tracrRNA。 核苷酸1–32是天然存在的crRNA。 核苷酸37-100是天然存在的tracrRNA。在两个片段之间添加了一个GAAA接头,使它们成为单个RNA片段。
Cas12的作用机制:
CRISPR-Cas12系统在向导RNA的引导下识别含PAM的dsDNA,然后促使靶标dsDNA解链,解链后的靶标dsDNA中的靶标链(TS)与向导RNA形成Rloop,近而释放出Cas12中的RuvC的活性位点;而刚刚解链后的靶标dsDNA中的非靶标链(NTS)此时就会被释放出的活性位点的RuvC切割;这一切割的结果造成靶标DNA的解旋,释放出的靶标dsDNA的TS被RuvC切割;当Cas12完成对靶标dsDNA中的TS和NTS的切割后(顺式切割),会释放出dsDNA,而此时空间被留出来的RuvC的活性位点,一旦有ssDNA进入,都会被切割(反式切割)。
CRISPR Cas12a蛋白和CRISPRCas12b蛋白是CRISPR Cas蛋白 Class2 V型中的亚型,V-A cas12a, 又叫cpf1; V-B cas12b, 又称 c2c1。Cas12b和Cas12a的主要区别是:
1. 核酸酶结构域不同,Cas12b蛋白的结构域是RuvC;Cas12a蛋白的结构域是RuvC和Nuc。
2. 向导RNA不同。Cas12b需要crRNA和tracrRNA;Cas12a只需要crRNA,不用tracrRNA。
3. 酶切方式不同。Cas12b酶切7个交错核苷酸;Cas12a酶切的是交错末端,5′ overhangs。
4. 应用技术不同。Cas12b蛋白应用的技术是HOLMES v2;Cas12a‍蛋白‍应用的技术是DETECTR和HOLMES。

       

                               
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Cas13a的作用机制:
CRISPR-Cas13系统与crRNA、底物结合形成三元复合体后,Cas13蛋白被激活,此时Cas13蛋白不仅能切割底物RNA,还能切割游离在环境内的任意单链RNA。Cas13a蛋白和Cas13b蛋白是RNA酶,基于Cas13a和Cas13b的检测需要RNA聚合酶的转录步骤。
Cas13a只需要24个碱基的crRNA,它通过富含尿嘧啶的茎环结构与Cas13a分子相互作用,并通过Cas13a的一系列构象变化来促进目标的切割。与Cas9一样,Cas13a也能容忍crRNA与目标序列之间的单个错配,不过若存在2个错配,那切割效率就大大降低。它的PFS序列(相当于PAM序列)位于间隔区的3’端,由A、U 或C碱基组成。
Cas13a还有一个特别之处,那就是Cas13a一旦识别并切割由crRNA序列指定的RNA目标,它就转入了一种酶促“激活”状态,这时它将结合并切割其他的RNA,而不管它们是否与crRNA同源,或是否存在PFS。这一点与Cas9截然不同。对于细菌而言,这种性质是有意义的。若细菌被噬菌体感染,它能够激活程序性细胞死亡或休眠状态,以限制感染在整个群体中的传播。
像Cas13a一样,Cas13b仅需要单个向导RNA就能找到靶标,并且从遗传学的角度是可编码的。此外,Cas13b能够同时靶向多个RNA转录本。但Cas13b也有一些独特的特点,表明它与Cas13a是不同的。这些特性使得Cas13b更适用于微调基因功能。

       

                               
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Cas14a作用机制:
Cas14a核酸酶是一种内切核酸酶,其在tracrRNA:crRNA(或sgRNA)的引导下,特异结合并切割靶标ssDNA,且无需PAM位点。相比于其他的Cas蛋白,Cas14蛋白的分子量普遍较小(400-700aa);与Cas12类似,Cas14a也可以结合靶标核酸并激活其ssDNA反式切割活性,从而被应用于靶标核酸的分子检测;与Cas12不同的是,Cas14a只能结合ssDNA靶标,因此经过扩增富集的靶标核酸需使用T7核酸外切酶进行处理,且其中一条扩增引物需要使用磷硫酰化修饰以确保T7核酸外切酶仅切割其中一条链,从而留下ssDNA靶标链以用于Cas14a介导的分子检测。
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